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Definindo o N filarial
Scientific Reports volume 13, Número do artigo: 7951 (2023) Citar este artigo
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Detalhes das métricas
A glicosilação ligada a N é uma modificação pós-traducional crítica de proteínas eucarióticas. Os glicanos ligados a N estão presentes na superfície e nas proteínas filariais secretadas que desempenham um papel nas interações parasitas do hospedeiro. Exemplos de proteínas glicosiladas de Brugia malayi foram previamente identificados, mas não houve um estudo sistemático do glicoproteoma ligado a N deste ou de qualquer outro parasita filarial. Neste estudo, aplicamos um protocolo N-glico FASP aprimorado usando uma proteína de ligação a carboidratos, Fbs1, para enriquecer peptídeos N-glicosilados para análise por LC-MS/MS. Em seguida, mapeamos os N-glicositos em proteínas de três estágios do hospedeiro do parasita: fêmea adulta, macho adulto e microfilárias. O enriquecimento de Fbs1 de peptídeos N-glicosilados aumentou a identificação de N-glicositos. Nossos dados identificaram 582 glicoproteínas N-ligadas com 1273 N-glicositos. A ontologia genética e a previsão da localização celular das N-glicoproteínas identificadas indicaram que eram principalmente proteínas de membrana e extracelulares. Comparando os resultados de vermes fêmeas adultos, vermes machos adultos e microfilárias, encontramos variabilidade na N-glicosilação no nível da proteína, bem como no nível individual da N-glicosita. Essas variações são destacadas nas N-glicoproteínas da cutícula e nas N-glicoproteínas restritas ao verme adulto como exemplos de proteínas na interface do parasita hospedeiro que estão bem posicionadas como potenciais alvos terapêuticos ou biomarcadores.
Brugia malayi é um dos três parasitas filariais humanos que causam a filariose linfática, uma doença tropical debilitante e crônica negligenciada que atualmente ameaça mais de 859 milhões de pessoas em 50 países em todo o mundo1,2. Os sintomas em indivíduos podem variar de leves a graves, incluindo danos ao sistema linfático e aos rins e eventual entupimento dos vasos linfáticos com inchaço da genitália e dos membros1,2. Vermes adultos que residem no sistema linfático de indivíduos imunocompetentes podem sobreviver por uma média de 6 a 8 anos. Os vermes fêmeas liberam milhões de microfilárias (larvas imaturas), que seguem para a corrente sanguínea, onde podem ser ingeridas pela alimentação de mosquitos, o inseto vetor desses parasitas. Dentro dos mosquitos, as microfilárias mudam e se desenvolvem através de vários estágios até o terceiro estágio larval infeccioso (L3), que pode então ser transmitido por meio de uma refeição de sangue para outros humanos. Essas larvas L3 mudam e amadurecem à medida que migram para o sistema linfático, onde completam o ciclo de vida1,2. Mais de 7 bilhões de tratamentos foram entregues em 66 países para combater a filariose linfática como parte do esforço da OMS para eliminar a doença1,3. Os tratamentos atuais, embora eficazes na redução da transmissão ao diminuir ou eliminar as microfilárias circulantes no sangue, não matam os vermes adultos responsáveis pelos sintomas associados à filariose3,4. Além disso, foram feitos relatos de resistência emergente aos tratamentos atuais5,6. Para expandir as medidas de controle disponíveis, são necessários estudos adicionais para aumentar as opções de drogas disponíveis e alvos de drogas.
As interações mediadas por parasitas com o hospedeiro mamífero, como imunomodulação e evasão imune, permitem que B. malayi e outros parasitas filariais existam por muitos anos em hospedeiros imunocompetentes e representam uma área ativa de investigação7. Glicoconjugados presentes na superfície do verme, secretados, excretados ou presentes em vesículas extracelulares liberadas pelo parasita no hospedeiro fazem parte de mecanismos cruciais que permitem que esses parasitas existam por anos sem eliminação8,9,10,11. A caracterização detalhada dessas moléculas críticas e suas vias de síntese podem destacar biomarcadores candidatos, alvos terapêuticos, moléculas de vacina ou ferramentas de diagnóstico para desenvolvimento posterior. Por exemplo, o teste diagnóstico atual para a filariose linfática é a detecção do antígeno filarial circulante Wuchereria bancrofti por um anticorpo monoclonal12. Estudos recentes mostraram que o epítopo reconhecido é um glicano e estudos adicionais são necessários para caracterizar completamente a estrutura13.
For parasitic nematodes, the host parasite interface can be defined as the cuticle or outer exoskeleton covering of the worm, excretory-secretory (ES) components, and extracellular vesicles. Early studies of filarial worm cuticle proteins identified two B. malayi glycoproteins. gp29 (Bm2151) is a major surface glycoprotein found in the cuticle of adult worms with homology to the glutathione peroxidases that are part of the oxidative stress response22. gp15/400 (Bm6083 or Bm6084, Bma-npa-1) is a nematode polyprotein allergen related glycoprotein found in the cuticle of the adult worms and is thought to play a role in acquiring the required fatty acids that the worms cannot synthesize de novo22,23. Recently, gp15/400 was described as an immunodominant antigen targeted by human IgE monoclonal antibodies produced from parasite infected human sera24. Later studies broadened the number of cuticle associated proteins but little is known about their glycosylation status25. ES-62 (Bm9816) is a major secreted glycoprotein in filarial nematodes26,27 and of special interest due to immunomodulatory phosphorylcholine substitution of its N-glycans8,9,26. Larger proteomic studies of excreted and secreted proteins28,29, extracellular vesicle proteins30 and membrane or surface enriched proteins31 highlighted more proteins that are exposed to the mammalian host. However, the possibility of glycan-mediated interactions with the host were not addressed in these strictly proteomic analyses. N-linked glycosite mapping in Caenorhabditis elegans, a soil living nematode, identified 829 N-linked glycoproteins in one study and 1010 N-linked glycoproteins in a second21,32. These studies that identified over a thousand N-glycoproteins included all stages (egg, L1, L2, L3, L4, and adult worms) of the nematode life cycle (2015)." href="/articles/s41598-023-34936-9#ref-CR33" id="ref-link-section-d12369696e568"33. A recent glycosite mapping of a Clade V34 parasitic nematode, Haemonchus contortus, identified 291 N-linked glycoproteins35 from only a mixed adult worm sample./p> We used NetNGlyc-1.046 to find the canonical N-X-S/T glycosites present in each N-glycoprotein. We used Weblogo47 to create a sequence logo for extracted -10 to + 10 amino acid sequences. We used BioVenn48 to generate a proportional Venn diagram. We used TMHMM-2.049 to predict transmembrane domains. We used UpsetR50 to generate UpsetR intersecting set plots. The gene ontology identification and functional enrichment analysis was performed using g:Profiler (version e105_eg52_p16_e84549f.) with g:SCS multiple testing correction method applying significance threshold of 0.0551. We used ggplot (2016)." href="/articles/s41598-023-34936-9#ref-CR52" id="ref-link-section-d12369696e755"52 to generate scatter plots from gene enrichment data analysis. We used DeepLoc to predict subcellular localization for each N-glycoprotein53. We used Parasite Biomart at Wormbase to search for both C. elegans and H. contortus orthologs to identified B. malayi N-glycoproteins54. We used Clustal Omega to generate a multiple sequence alignment55./p>